日期:2022年10月28日 15:30
来源:沧州医教研究
作者:赵晨光 霍景瑞 王亚冰 刘英富 杨晓晖(通信作者)
点击:[ ]
灯笼草因其果实像灯笼,故以灯笼为名,又名酸浆、锦灯笼、苦灯笼、黄菇娘等,为直立多年生草本植物,在我国各地均有分布,是我国传统中药中的一种。根据《南宁市药物志》记载,灯笼草味苦微甘,有清热杀虫、止痛消肿之效,在毒疮、疱疹、疖疮、疝气以及伤寒等的治疗上都有奇效。研究表明,灯笼草中含有酸浆苦素类物质,具有体外抗肿瘤的作用,能有效抑制癌细胞的生长繁殖。本研究探讨灯笼草提取物对体外肝癌细胞活性的影响。
制备灯笼草提取物。取200g灯笼草,分批加入到500mL液氮中速冻并捣碎至粉末状,取100g粉末,加入200mL去离子水浸泡24h,蒸煮,冷却,离心,过滤除菌,制备无菌溶液备用。
取出冻存的人H22肝癌细胞,在37℃水浴锅中快速融化后,1000rpm离心5min。弃除冻存液,用新鲜配制的细胞培养基(RPMI-1640内含10%小牛血清)重悬细胞沉淀,重悬液转移至T25细胞培养瓶,在37℃ 5% CO2培养箱中培养。
检测不同药物浓度对细胞生长的抑制率。收集处于对数生长期的H22细胞,计数后,用RPMI-1640培养基稀释至5000个每毫升,按0.1mL每孔接种于96孔细胞培养板,于5% CO2细胞培养箱中过夜培养。次日,每孔加入10μL不同浓度的灯笼草提取物,继续培养。实验设置空白对照组、正常对照组、实验组,空白对照孔中只有细胞培养基,正常对照组为正常培养的H22细胞,实验组中加入的药物的终浓度(μg/mL)分别为260、52、10.4、2.08、0.42,每组各设5个复孔。药物48h后,从细胞培养箱中取出培养板,在超净工作台下向每孔加入10μL CCK-8试剂,于细胞培养箱中继续孵育4h。孵育结束后,用酶标仪测定各组的吸光度值,按照试剂盒说明书方法计算不同浓度药物对细胞生长的抑制率,绘制药物浓度-抑制率关联曲线,计算半数抑制浓度IC50。
检测不同的药物作用时间对细胞生长抑制率。对数生长期的H22细胞,按5000个每孔接种于96孔细胞培养板中,培养过夜,然后每孔加入10μL灯笼草提取物(药物作用浓度为14.2μg/ml)。实验设置空白对照组、正常对照组、实验组,实验组设置3个药物作用时间(24h、48h、72h、96h)。药物作用结束后,每孔加入10μL CCK-8试剂,于细胞培养箱中继续孵育4h。孵育结束后,测定各组的吸光度值,计算各组的抑制率。
结果发现,灯笼草提取物对肝癌细胞H22的初始作用浓度为260μg/mL。药物作用细胞48h后,高浓度的灯笼草提取物能显著抑制肝癌细胞生长(260μg/mL抑制率为95.13%、52μg/mL抑制率为76.65%),而且提取物对细胞的生长抑制呈现显著的浓度依赖性(图1)。根据线性拟合公式,计算得出灯笼草提取物对H22生长的半数抑制浓度IC50为14.2μg/ml,以此浓度作为后续细胞实验研究的药物作用浓度。

图1 不同浓度药物对H22生长的抑制作用
灯笼草提取物可以剂量依赖性抑制肝癌细胞H22的生长,其半数抑制浓度为14.2μg/ml。采用CCK-8法考察灯笼草提取物作用24h、48h、72h、96h后,药物对H22细胞的抑制率(表1)。
表1 药物作用时间与细胞抑制率的关系
作用时间(h) |
抑制率(%) |
24 |
23.25±3.21 |
48 |
52.81±4.63** |
72 |
63.03±4.50** |
96 |
39.41±4.36* |
注:*: p<0.05;**: p<0.01
药物作用48h、72h的抑制率明显高于24h组(52.81% vs 23.25%,p<0.01;63.03% vs 23.25%,p<0.01),差异有统计学意义;药物作用96h时,细胞生长抑制率有所降低(39.41% vs 23.25%,p<0.05)(图2)。

图2 灯笼草对H22生长抑制作用与时间的关系
灯笼草根茎含有丰富的有机酸、氨基酸、黄酮甙、酚类及糖类等有机物质,果壳含柠檬酸、植物甾醇、无定形甙、鞣质、还原糖等物质。在上世纪90年代农村,灯笼草主要用于治疗感冒、咽喉肿痛、腮腺炎等病症。现代研究表明灯笼草具有多种药理作用,灯笼草提取物可使肠道的通透性增加且具有抗原性,对食物过敏具有明显地调节和缓解作用,对免疫性肝损伤具有较强的治疗效果,可有效抑制c–fos、c-jun、HMGB1的表达。
Yen CY等研究表明,在灯笼草内有一种叫做4β羟基睡茄内酯E的内酯成分对多种肿瘤细胞有抑制作用,并且这种内酯成分对人肺腺癌细胞拥有非常强大的抑制作用,、You BJ、Wu SJ、Quispe-Mauricio A等团队分别发现灯笼草对多种癌症细胞有抑制作用,因此我们选用肝癌细胞作为研究对象,研究灯笼草对癌细胞活性的影响。实验结果显示,高浓度的灯笼草提取物能显著抑制肝癌细胞生长,而且提取物对细胞的生长抑制呈现显著的浓度依赖性,随着对灯笼草提取液的稀释,对肿瘤细胞的抑制作用减小。同时,灯笼草提取液对细胞生长的抑制作用呈时间依赖性增长,但是在药物作用96h后,抑制率没有升高,反而抑制率变小,可能原因是药物在37℃时间过长导致其有效成分降解,而且部分对药物作用不明显的细胞扩增导致活细胞增多。
综上所述,灯笼草提取物能够有效抑制肝癌细胞H22的生长增殖,为灯笼草作为临床癌症辅助治疗药物提供科学依据。
(第一作者系医学系学生,指导教师:杨晓晖)