中国是全球糖尿病患者人数最多的国家，2017年流行病学数据显示，中国糖尿病患病率为10.9%。过去30年来，中国糖尿病患病率急剧增加，让糖尿病成为中国医学上的重大难题。糖尿病根据疾病的病因不同，主要分为四种类型：1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病和其他特殊类型糖尿病，其中最常见的是2型糖尿病，约占糖尿病总人数的90%以上。

2型糖尿病发病的主要原因是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷，但谁处于主导地位尚存在争议。有尸检发现，肥胖的2型糖尿病患者胰岛β细胞数量仅是非糖尿病（肥胖）者的50%，提示β细胞凋亡参与了2型糖尿病的发生发展；也因此提示，有效抑制β细胞凋亡可能对于控制2型糖尿病的进展具有重要意义。

自1972年Kerr提出细胞凋亡（apoptosis）的概念以来，人们对细胞凋亡现象进行了广泛、深入的研究。在调控细胞凋亡的一系列原癌基因和抑制癌基因中，Bcl-2家族起着决定性的作用。Bcl-2（B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种癌基因，具有抑制凋亡的作用，并且近年来的一些研究已开始揭示其抑制凋亡的作用机制。丝胶（或称丝胶蛋白）为蚕茧中的水溶性蛋白，科学研究发现，丝胶可降低2型糖尿病大鼠的血糖水平，且能抑制模型大鼠血糖水平的升高，但丝胶降血糖的作用机制尚未明了。

因此，我们选择大鼠胰岛素瘤细胞（INS-1细胞）为研究对象，以链脲佐菌素（STZ）处理INS-1细胞模拟高血糖损伤，探讨分析丝胶对INS-1细胞Bcl-2蛋白表达的作用。称取一定量由承德医学院蚕业研究所提供的黄色蚕茧，浴比1︰30，1%碳酸钠浸泡30min，煮沸3h，提取两次，两次的提取液减压浓缩，浓缩液经8000nm-14000nm透析袋透析过夜，透析液冷冻干燥成粉末，-20℃冰箱保存。临用时用完全培养基配制成溶液，0.22μm滤器过滤除菌。大鼠INS-1细胞，购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司，用含FBS（10%）和β-巯基乙醇（50μmol/L）的RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO₂培养箱中贴壁培养2～3天，至80%～90%融合后传代，取对数生长期细胞进行实验。INS-1细胞分为三组，正常对照组、STZ损伤组和丝胶处理组。正常对照组细胞用不含药物的完全培养基培养；STZ损伤组细胞用完全培养基配制的STZ溶液培养24h，STZ（美国Sigma公司，-20℃冰箱保存）终浓度为10mmol/L；丝胶处理组细胞用完全培养基配制的同时含STZ（终浓度为10mmol/L）和丝胶（终浓度为300μg/ml）的溶液培养24h。

INS-1细胞按1×105 个/ml接种于6孔板，贴壁培养至对数生长期后用PBS清洗细胞，以换液的形式分别给予各组INS-1细胞不同的药物处理，孵育24h后将6孔板置于倒置显微镜下观察各组细胞的形态。细胞培养结束后，向各组INS-1细胞中加入蛋白裂解液，以反复冻融的方式提取各组细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝生物有限公司）定量。蛋白上样量30μg，15% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗（艾博抗(上海)贸易有限公司，1:500）室温孵育2h，二抗(1:5000，美国KPL公司)室温摇床孵育2h，Super ECL Plus超敏发光液显影。扫描胶片后，应用Quantity One-v 4.6.2软件分析显影条带，以目的条带与β-actin条带的灰度比值，作为Bcl-2蛋白的相对表达水平。

各组INS-1细胞的形态见图1。

图1 各组INS-1细胞的形态（×200）（A.正常对照组，B.STZ损伤组，C.丝胶处理组）

由图1可见：正常对照组INS-1细胞数量较多，单层生长，分布均匀，呈不规则多边形，细胞有连接融合倾向；STZ损伤组INS-1细胞间隙增宽，出现漂浮、脱落现象，贴壁细胞数量减少，细胞形态发生改变：细胞变圆，体积变小；与STZ损伤组相比，丝胶处理组细胞间隙变窄，漂浮、脱落细胞减少，细胞形态趋于正常。

各组INS-1细胞Bcl-2蛋白的表达情况见图2和表1。

图2 各组INS-1细胞Bcl-2蛋白的表达 （1.正常对照组，2.STZ损伤组，3.丝胶处理组）

表1 各组INS-1细胞Bcl-2蛋白的表达情况（ x ± s ）

由图2和表1可知:与正常对照组相比，STZ损伤组INS-1细胞Bcl-2蛋白的表达明显降低(P＜0.05)；与STZ损伤组比较，丝胶处理组细胞Bcl-2蛋白的表达明显升高(P＜0.05)。

2型糖尿病发病的主要原因是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷，但谁处于主导地位尚存在争议。有尸检发现，肥胖的2型糖尿病患者胰岛β细胞数量仅是非糖尿病（肥胖）者的50%，提示β细胞凋亡参与了2型糖尿病的发生发展；那么，有效抑制β细胞凋亡可能对于控制2型糖尿病的进展具有重要意义。

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中具有重要意义，在生物体的进化、内环境的稳定及多系统的发育中发挥重要作用。凋亡具有复杂的分子生物学机制，是多基因严格控制的过程，虽然目前凋亡过程的确切机制尚不完全清楚，但凋亡过程的紊乱可能与多种病变相关，如肿瘤、自身免疫性疾病等。Bcl-2家族是众多调控细胞凋亡的因子之一，其抑制细胞凋亡的作用可能与以下因素有关：Bcl-2可以抑制细胞色素c（Cyt c）的释放，从而抑制超氧阴离子的产生，通过抗氧化作用抑制细胞凋亡；Bcl-2具有抑制Ca²⁺跨膜流动的作用，通过调节细胞内Ca²⁺的浓度调节凋亡；过度表达的Bcl-2能抑制线粒体通透性的改变，并影响巨孔的形成，从而抑制凋亡。

我国最早将糖尿病成书的是《黄帝内经》，《素问》提及了“消渴病”（即糖尿病）的病名，中医辩证观点认为糖尿病是一种气阴两虚的慢性代谢紊乱疾病，符合中医“多虚、多瘀”的观点，治疗原则是生精清热、润燥养阴等。蚕茧，别名蚕衣、茧黄、绵蚕等，为蚕蛾科昆虫家蚕蛾的茧壳，具有滋阴润燥、生精止渴的作用，主治肠风便血、淋痛尿血、消渴饮引等，且民间亦有蚕茧泡水辅助降糖的用法。以往科学研究发现丝胶具有明显的降血糖作用，但具体机制不明。因此，我们以大鼠胰岛素瘤INS-1细胞为研究对象，采用STZ损伤INS-1细胞建立模型，结果显示，丝胶处理INS-1细胞可明显升高Bcl-2蛋白的表达。所以，丝胶可能通过上调Bcl-2蛋白的表达抑制β细胞凋亡，从而发挥降低血糖的作用。也就是说，有效抑制β细胞凋亡或许可以控制2型糖尿病的进展。

（第一作者作者系沧州医学高等专科学校，讲师）